Skuteczność preparatów probiotycznych nie jest determinowana wyłącznie liczebnością żywych komórek mikroorganizmów, wyrażaną jako jednostki tworzące kolonie, lecz w istotnym stopniu zależy od ich stanu fizjologicznego oraz witalności. Bakterie poddane działaniu czynników stresowych, takich jak zmiany pH, temperatura, dostępność substratów czy procesy technologiczne, mogą zachowywać zdolność do wzrostu na podłożach mikrobiologicznych, jednocześnie wykazując obniżoną aktywność metaboliczną i funkcjonalną. Z tego względu kompleksowa ocena jakości bakterii probiotycznych powinna uwzględniać zarówno parametry ilościowe, jak i jakościowe. Celem niniejszych badań była ocena jakości oraz witalności szczepów probiotycznych stosowanych w produktach, na podstawie analizy fenotypu kolonii bakteryjnych oraz morfologii komórek obserwowanych w mikroskopii świetlnej.
| 2.1. Materiał biologiczny | 2.3. Ocena mikroskopowa – morfologia komórek |
|
Badaniom poddano szczepy bakterii probiotycznych należące do rodzajów Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. oraz Streptococcus thermophilus, pozyskane z gotowego produktu w formie płynnej – EKO Probiotyk Joy Day.
|
Z wybranych kolonii przygotowywano preparaty mikroskopowe, które następnie barwiono metodą Grama. Obserwacje prowadzono w jasnym polu przy użyciu mikroskopu świetlnego Zeiss, w powiększeniu 1000x z zastosowaniem immersji olejowej.
|
| 2.2. Ocena makroskopowa – analiza fenotypu kolonii | Analizie podlegały: |
|
Makroskopową ocenę drobnoustrojów przeprowadzono metodą posiewu redukcyjnego na selektywnych i półselektywnych podłożach: • MRS agar – dla bakterii z rodzaju Lactobacillus, • BSM agar- dla bakterii z rodzaju Bifidobacterium. Posiewy inkubowano w warunkach odpowiednich dla poszczególnych grup bakterii. Do analizy fenotypowej wybierano pojedyncze, dobrze wyodrębnione kolonie z trzeciej oraz czwartej strefy posiewu, które w największym stopniu odzwierciedlają naturalne cechy wzrostowe szczepów. |
• kształt komórek, • sposób ich ułożenia, • jednorodność populacji, • obecność ewentualnych form atypowych mogących świadczyć o stresie fizjologicznym lub uszkodzeniach komórkowych.
|
Analiza makroskopowa wykazała, że wszystkie badane szczepy tworzyły kolonie o morfologii zgodnej z cechami referencyjnymi dla poszczególnych grup taksonomicznych. Kolonie były dobrze wykształcone, o typowej barwie i strukturze, co wskazuje na wysoką witalność komórek oraz prawidłowy przebieg procesów metabolicznych. Nie obserwowano masowego występowania kolonii drobnych, zdeformowanych ani o nietypowej barwie, które mogłyby sugerować wcześniejsze narażenie mikroorganizmów na niekorzystne warunki środowiskowe.
Lactobacillus spp. Komórki w postaci laseczek Gram-dodatnich, układających się w łańcuszki, katalazo-ujemne. Na podłożach stałych tworzyły mleczno-białe, łezkowate kolonie, często częściowo wrośnięte w podłoże. Taki fenotyp uznawany jest za charakterystyczny dla szczepów wykazujących dobrą adhezję oraz wysoką aktywność metaboliczną.
Bifidobacterium spp. Komórki Gram-dodatnie w postaci pałeczek, często układających się w palisady lub łańcuszki. Kolonie drobne, regularne, o barwie brunatno-czerwonej, niekiedy z jasną otoczką. Obserwowany fenotyp był zgodny z opisami literaturowymi dla tej grupy bakterii.
Streptococcus thermophilus Ziarniaki Gram-dodatnie, tworzące charakterystyczne paciorki. Kolonie drobne, okrągłe, białe, o jednorodnej strukturze, typowe dla szczepów technologicznych stosowanych w fermentacjach.
Podpis: Fot. 1. Wzrost kolonii bakterii na podłożu stałym: A – Lactobacillus, B – Bifidobacterium.
Podpis: Fot. 2. Obraz mikroskopowy bakterii Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103), powiększenie mikroskopu 1000x.
Porównanie kolonii uzyskanych z produktów płynnych oraz liofilizowanych wykazało widoczne różnice fenotypowe, co wskazuje na istotny wpływ formy produktu oraz procesu technologicznego na cechy wzrostowe bakterii. Wyniki te podkreślają znaczenie prowadzenia kontroli jakości na każdym etapie procesu – od hodowli, przez przetwarzanie, aż po przechowywanie gotowego produktu.
[TUTAJ WKLEJ OBRAZ: Fot. 3] Podpis: Fot. 3. Obraz prezentujący różnice pomiędzy fenotypem kolonii drobnoustrojów probiotycznych: A i B – kolonie pochodzące z produktów liofilizowanych, C – kolonie pochodzące z produktu płynnego.
| 4. DYSKUSJA | 5. WNIOSKI |
|
Uzyskane wyniki potwierdzają, że ocena jakości probiotyków nie powinna ograniczać się wyłącznie do oznaczania liczby jednostek CFU/AFU. Zachowanie typowego fenotypu kolonii oraz prawidłowej morfologii komórek stanowi istotny wskaźnik dobrej kondycji fizjologicznej bakterii, która warunkuje ich zdolność do pełnienia funkcji biologicznych po podaniu do organizmu.
|
1. Badane szczepy bakterii probiotycznych wykazują cechy morfologiczne typowe dla swoich grup taksonomicznych.
2. Fenotyp kolonii oraz morfologia komórek wskazują na dobrą kondycję fizjologiczną i wysoką witalność drobnoustrojów.
3. Prowadzona kontrola makroskopowa i mikroskopowa stanowi istotny element oceny jakości bakterii zarówno na etapie produkcji, jak i przechowywania gotowych preparatów.
4. Forma produktu wpływa na cechy wzrostowe bakterii, co potwierdza zasadność stosowania wieloetapowej kontroli jakości. |