Każdy szczep bakterii probiotycznych charakteryzuje się unikalnym profilem metabolitów wtórnych, wynikającym z jego aktywności metabolicznej oraz warunków środowiskowych, w jakich prowadzony jest proces hodowli i fermentacji. W trakcie wzrostu drobnoustroje wykorzystują składniki pożywki nie tylko do syntezy biomasy komórkowej, lecz również do produkcji szeregu związków bioaktywnych, które pełnią istotne funkcje ochronne, regulacyjne oraz stabilizujące.
Metabolity te są wydzielane do środowiska pozakomórkowego i stanowią integralny element naturalnych mechanizmów:
utrzymania homeostazy komórkowej,
konkurencji mikrobiologicznej,
stabilizacji warunków wzrostu i przeżywalności bakterii.
Ich obecność w gotowych produktach probiotycznych ma kluczowe znaczenie dla biofunkcjonalności preparatu, wpływając zarówno na jego aktywność biologiczną, jak i trwałość oraz stabilność mikrobiologiczną.
Dominującą grupą metabolitów wytwarzanych przez bakterie probiotyczne są kwasy organiczne, powstające w wyniku procesów homo- i heterofermentacji mlekowej. Do najistotniejszych związków należą:
kwas mlekowy,
kwas octowy,
kwas propionowy.
Kwasy te pełnią fundamentalną rolę w modulowaniu pH środowiska oraz w ograniczaniu rozwoju mikroorganizmów niepożądanych. Spośród nich szczególne znaczenie wykazuje kwas octowy, który charakteryzuje się silnym działaniem hamującym wobec bakterii, drożdży oraz pleśni.
Mechanizm jego aktywności obejmuje:
obniżanie pH środowiska do poziomu niekorzystnego dla patogenów,
zakłócanie wewnątrzkomórkowych procesów metabolicznych,
zaburzenie transportu aktywnego przez błony komórkowe drobnoustrojów niepożądanych.
Istotnym metabolitem wytwarzanym przez wybrane szczepy bakterii mlekowych jest również diacetyl – lotny diketon powstający w wyniku przemian pirogronianu. Związek ten syntetyzowany jest m.in. przez szczepy z rodzaju Lactobacillus, Leuconostoc oraz Streptococcus i wykazuje działanie bakteriobójcze wobec niektórych bakterii Gram-ujemnych, między innymi poprzez inaktywację szlaku metabolicznego argininy.
W warunkach tlenowych bakterie mlekowe mogą syntetyzować nadtlenek wodoru, który powstaje na skutek aktywności oksydaz flawoproteinowych oraz peroksydaz NADH. Nadtlenek wodoru wykazuje silne właściwości antymikrobiologiczne, prowadzące do:
denaturacji enzymów komórkowych,
peroksydacji lipidów błonowych,
zaburzeń integralności błon komórkowych drobnoustrojów patogennych.
Dodatkowo w procesie heterofermentacji mlekowej wytwarzany jest dwutlenek węgla, który wykazuje działanie bakteriostatyczne, a w wyższych stężeniach również bakteriobójcze, szczególnie wobec bakterii Gram-ujemnych.
W badanym produkcie (EKO Probiotyk Joy Day) potwierdzono obecność łącznie 11 związków wykazujących właściwości biofunkcjonalne oraz antyseptyczne. Do zidentyfikowanych metabolitów należały między innymi:
kwas walerianowy,
kwas heptanowy,
kwas octowy,
kwas benzoesowy,
aldehyd benzoesowy,
1,2-propanodiol,
dodekanol,
estry organiczne, w tym estry etylowe, metylowe oraz alkilowe.
Uzyskany profil metabolitów potwierdza wysoką aktywność metaboliczną bakterii probiotycznych obecnych w produktach oraz wskazuje na ich potencjał wspierający stabilność mikrobiologiczną i biofunkcjonalność preparatów.
Bakterie probiotyczne syntetyzują również bakteriocyny – rybosomalnie produkowane substancje białkowe lub peptydowe o selektywnym działaniu przeciwdrobnoustrojowym. Związki te wykazują aktywność głównie wobec bakterii blisko spokrewnionych taksonomicznie, przy jednoczesnej naturalnej odporności szczepów produkujących bakteriocyny na ich własne działanie.
Obecność bakteriocyn w produktach probiotycznych stanowi istotny element mechanizmu konkurencji mikrobiologicznej oraz wspiera stabilność mikrobiologiczną preparatu.
Analizę jakościową i ilościową metabolitów przeprowadzono z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Badania wykonano przy użyciu chromatografu Agilent Technologies 1200 Series.
Rozdział chromatograficzny prowadzono na kolumnie Rezex ROA, przy objętości nastrzyku 10 μl. Jako fazę ruchomą zastosowano roztwór 0,005 N H₂SO₄, przy przepływie 0,6 ml/min oraz temperaturze kolumny wynoszącej 40°C.
Identyfikację związków przeprowadzono metodą standardu zewnętrznego na podstawie analizy czasu retencji oraz pola powierzchni pików chromatograficznych.
(patrz wykres – profil metabolitów preparatu EKO Probiotyk Joy Day)
Badane szczepy bakterii probiotycznych wykazują zdolność do syntezy szerokiego spektrum metabolitów o udokumentowanych właściwościach bioaktywnych.
Obecność kwasów organicznych, związków lotnych oraz bakteriocyn stanowi istotny element mechanizmów ochronnych i stabilizujących produkty probiotyczne.
Zastosowana metodyka HPLC umożliwia precyzyjną identyfikację i ocenę profilu metabolitów, stanowiąc ważne narzędzie kontroli jakości i charakterystyki biofunkcjonalnej preparatów.
Profil metabolitów potwierdza zasadność traktowania produktów jako systemów probiotyczno-postbiotycznych, a nie wyłącznie nośników żywych komórek bakteryjnych.