Promowany w ostatnich latach zdrowy styl życia przejawia się głównie dbałością o zdrowie i podejmowaniem aktywności fizycznej. Ma to zapewnić dłuższe życie w optymalnej kondycji psychofizycznej. W związku z tym zwiększa się zapotrzebowanie na suplementy diety i żywność o najwyższej wartości żywieniowej, a dodatkowo o określonych właściwościach prozdrowotnych. W Polsce największym zainteresowaniem wśród świadomych, dbających oz drowie konsumentów cieszy się właśnie żywność probiotyczna.
Wśród przyczyn rosnącego zapotrzebowania na żywność wzbogaconą o dodatkowe komponenty mające na celu poprawę jej walorów zdrowotnych i smakowych należy wymienić w szczególności: starzenie się społeczeństwa, wzrost kosztów opieki medycznej i społecznej, wzrost częstości występowania dietozależnych schorzeń chronicznych, rozwój wiedzy dotyczącej biologicznie aktywnych, tzw. nieodżywczych składników żywności i ich fizjologicznego oddziaływania na organizm człowieka, wzrost siły nabywczej konsumentów w krajach rozwiniętych/rozwijających się, rozwój technik i technologii przetwórstwa surowców spożywczych, dostępność nowych bioaktywnych składników żywności (nutraceutyków) i sytuacja przemysłu żywnościowego w krajach rozwiniętych.
Dzisiejszy konsument zdaje sobie sprawę, że nie tylko zdrowa dieta, ale i aktywność fizyczna pozytywnie wpływa na ich wygląd i samopoczucie. W związku z tym rośnie zapotrzebowanie na produkty, które wspierają wydolność fizyczną, dodają energii czy też ułatwiają redukcję masy ciała. Aby sprostać oczekiwaniom konsumentów, w obecnej chwili wiele liczących się na rynku firm spożywczych podążając za rozwijającym się trendem prozdrowotnym, planuje wprowadzić do swojego asortymentu produkty, które charakteryzowałyby się pozytywnym wpływem na organizm człowieka.
Wpływ trawienia in vitro na liczebność drobnoustrojów probiotycznych obecnych w płynnych produktach firmy Living Food
Jednym z fundamentalnych elementów oceny biofunkcjonalności produktów są badania mające na celu ocenę stabilności i efektywności działania substancji aktywnych, soli mineralnych, mikroorganizmów w warunkach symulujących przewód pokarmowy. Z uwagi na trudności w dostępie do treści jelitowych in vivo, rozwinięte zostały badania nad modelami umożliwiającymi badanie trawienia i wchłaniania w warunkach in vitro. Modele te są dużo szybszym i tańszym sposobem w porównaniu z badaniami prowadzonymi na zwierzętach.
W publikacjach naukowych opisano badania, w których wykorzystano mniej lub bardziej zautomatyzowane modele przewodu pokarmowego in vitro. Te najbardziej zaawansowane modele są monitorowane komputerowo, gdzie oprócz regulacji pH i dodatku odpowiednich enzymów, imitowane są ruchy perystaltyczne i wchłanianie przez ściany jelit. Znane są też badania, w których trawienie w przewodzie pokarmowym próbowano symulować przez stworzenie odpowiednich warunków w prostych naczyniach laboratoryjnych.
Badanie biodostępności składników pokarmowych i leków w warunkach naturalnych jest bardzo utrudnione, na co decydujący wpływ ma trudny dostęp do światła przewodu pokarmowego człowieka, szczególnie na odcinku jelita cienkiego. Stosowanie modeli in vitro, symulujących mniej lub bardziej dokładnie układ pokarmowy człowieka wpłynęło na szybki rozwój badań naukowych.
Zadania, które stanowią wyzwanie dla dzisiejszej biotechnologii dotyczą badań nad zależnościami pomiędzy kilkoma elementami aplikowanymi (np. antybiotyki, mikroorganizmy probiotyczne) do przewodu pokarmowego w warunkach in vitro. Ponadto badania nad interakcjami pomiędzy mikrobiomem jelitowym (tym prawidłowym i dysfunkcyjnym) a substancjami aktywnymi biologicznie w warunkach in vitro przewodu pokarmowego stanowią ważną, choć przysparzającą trudności analitycznych zależność.
Metodyka
W badaniach nad wpływem trawienia na drobnoustroje probiotyczne wchodzące w skład naszych produktów wykorzystano model przewodu pokarmowego in vitro. Nadrzędnym celem przeprowadzonych prac było określenie kinetyki zmian liczebności bakterii wchodzących w skład produktów probiotycznych w zależności od stosowanej matrycy żywnościowej. Układ eksperymentalny stanowił fermentor o pojemności 1 L (Sartorius – Polska). Temperatura układu eksperymentalnego była utrzymywana na poziomie 37°C.
W trakcie prowadzonych prac wykorzystano bufor PBS o pH 7.4 (symulacja pustego żołądka) i nośniki w postaci matryc żywnościowych: preparat mleko zastępczy Nutramigen, stosowany w alergii na białko mleka krowiego, bogaty w substancje odżywcze (oleje roślinne, hydrolizat kazeiny, składniki mineralne, witaminy); nieklarowany sok jabłkowo-marchwiowy Bobo Frut – bogate źródło błonnika (2 g/300 ml); kleik ryżowy BoboVita – produkt skrobiowy. Skrobia ryżowa jest najłatwiej przyswajalną przez organizm skrobią oraz wykazuje działanie prebiotyczne.
W pierwszej kolejności przygotowano mieszaninę produktu probiotycznego z buforem PBS lub produktu probiotycznego z wybraną matrycą żywieniową (P1)*. Tak przygotowaną próbę badawczą poddano pierwszemu etapowi trawienia in vitro, który miał na celu symulację warunków panujących w żołądku. W tym celu do mieszaniny imitującej płyn żołądkowy dodano pepsynę w ilości 300 U/ml i obniżono pH do wartości 4.0 za pomocą 1 M HCl. Etap prowadzono przez 4 h w temp. 37°C (P2). Ruchy perystaltyczne imitowano przez mieszanie zawiesiny przy użyciu mieszadła magnetycznego.
Kolejny etap miał na celu odwzorowanie warunków panujących w jelicie cienkim. W tym celu pH płynu wyregulowano do wartości 6.0, stosując 1 M NaHCO3. Następnie dodano 10 ml ekstraktu trzustkowo-jelitowego (P3). Kolejny etap polegał na podniesieniu pH do 7.4 przez dodanie 1 M NaHCO3. Ten etap prowadzono przez 2 h (P4). W celu symulacji pasażu produktu przez jelito grube pH podniesiono do wartości 8.0 za pomocą 2 M NaHCO3. Dalsze trawienie prowadzono w warunkach beztlenowych przez 18 h (P5).
*P=punkt pomiarowy
Analizę mikrobiologiczną przeprowadzono z zastosowaniem metody zalewowej Kocha. Oznaczano dwie grupy drobnoustrojów – bakterie z rodzaju Lactobacillus i bakterie z rodzaju Bifidobacterium.
Wyniki
W pierwszym etapie badań analizowano wzrost bakterii z rodzaju Lactobacillus i bakterii z rodzaju Bifidobacterium w buforze PBS. Zadaniem buforu PBS jest utrzymanie wartości pH na stałym poziomie. Wyniki prowadzonych badań przedstawiono w tabeli poniżej. Początkowo (P1), liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus wynosiła 1,9×108 jtk/g, a bakterii z rodzaju Bifidobacterium 2,6×108 jtk/g. Po 4 h inkubacji liczebność bakterii z rodzaju Lactobacillus obniżyła się do wartości 2,6×107 jtk/g, podobnie jak bakterii z rodzaju Bifidobacterium 1,4×107 jtk/g. W kolejnym etapie, symulującym środowisko jelita cienkiego w obecności soku trzustkowo-jelitowego liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus znów uległa obniżeniu do wartości 7,8×106 jtk/g. Natomiast liczba Bifidobacterium wynosiła na tym etapie 4,7×107 jtk/g. W kolejnym punkcie pomiarowym (P4), liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus uległa podwyższeniu do wartości 8,5×107 jtk/g, natomiast obniżyła się liczba Bifidobacterium (3,5×106 jtk/g). Po zakończeniu etapu symulującego pasaż przez jelito grube (P5), liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus była zbliżona do tej w etapie P4 i wynosiła 9,6×107 jtk/g. Natomiast liczba Bifidobacterium wzrosła do wartości 7,6×107 jtk/g.
Tabela 1. Kinetyka zmian liczby bakterii fermentacji mlekowej wchodzących w skład płynnego produktu probiotycznego w czasie pasażu żołądkowo-jelitowego
| per 100 ml | per serving 10 ml | % RWS* | ||
|---|---|---|---|---|
| energy | 84 kJ/20 kcal | 8 kJ/2 kcal | 0% | |
| fat | 0 g | 0 g | 0% | |
| including saturated fatty acids | 0 g | 0 g | 0% | |
| carbohydrates | 4,2 g | <0,5 g | 0% | |
| including sugars | <0,5 g | 0 g | 0% | |
| fiber | <0,5 g | 0 g | - | |
| protein | <0,7 g | 0 g | 0% | |
| salt | 0,02 g | 0 g | 0% |
W kolejnym etapie badań analizowano wpływ dodatku matrycy żywieniowej, preparatu Nutramigen na wzrost bakterii z rodzaju Lactobacillus i bakterii z rodzaju Bifidobacterium. Wyniki prowadzonych badań zaprezentowano w tabeli poniżej. Początkowo (P1), liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus wynosiła 1,4×108 jtk/g, a bakterii z rodzaju Bifidobacterium 2,2×108 jtk/g. Po 4 h inkubacji liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus wzrosła do wartości 7,2×109 jtk/g. Wzrost liczebności zaobserwowano również dla bakterii z rodzaju Bifidobacterium, a ich liczba wynosiła 3,4×109 jtk/g. W kolejnym etapie symulującym środowisko jelita cienkiego w obecności soku trzustkowo-jelitowego liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus ponownie uległa podwyższeniu, do wartości 8,5×109 jtk/g. Podobna obserwacja dotyczyła bakterii z rodzaju Bifidobacterium, których liczba na tym etapie eksperymentu wynosiła 5,2×109 jtk/g. W kolejnym punkcie pomiarowym (P4), liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus uległa obniżeniu do wartości 9,6×108 jtk/g, natomiast podwyższyła się liczba Bifidobacterium (7,7×109 jtk/g). Po zakończeniu etapu symulującego pasaż przez jelito grube (P5), liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus znów wzrosła i wynosiła 2,6×109 jtk/g, natomiast liczba Bifidobacterium utrzymała się na poziomie zbliżonym do liczby w etapie P4 i wynosiła 7,5×109 jtk/g.
Na podstawie przeprowadzonego doświadczenia można wywnioskować, że preparat Nutramigen zapewnił bardzo dobre warunki do wzrostu i namnażania zarówno bakterii z rodzaju Lactobacillus, jak i bakterii z rodzaju Bifidobacterium. Zapewne matryca żywnościowa o tak bogatym składzie (syrop glukozowy, hydrolizat kazeiny, składniki mineralne oraz witaminy) spełniła funkcję ochronną oraz prebiotyczną dla komórek bakterii probiotycznych.
Tabela 2. Kinetyka zmian liczby bakterii fermentacji mlekowej wchodzących w skład płynnego produktu probiotycznego w czasie pasażu żołądkowo-jelitowego w obecności preparatu Nutramigen
| per 100 ml | per serving125 ml | % RWS* | ||
|---|---|---|---|---|
| energy | 36 kJ/8 kcal | 45 kJ/10 kcal | 0% | |
| fat | 0 g | 0 g | 0% | |
| including saturated fatty acids | 0 g | 0 g | 0% | |
| carbohydrates | 2,1 g | 2,6 g | 0% | |
| including sugars | 0 g | 0 g | 0% | |
| fiber | 0 g | 0 g | - | |
| protein | 0 g | 0 g | 0% | |
| salt | 0,02 g | 0,02 g | 0% |
W kolejnym etapie badań analizowano wpływ dodatku matrycy żywieniowej o wysokiej zawartości błonnika, soku Bobo Frut, na wzrost bakterii z rodzaju Lactobacillus i bakterii z rodzaju Bifidobacterium. Wyniki przeprowadzonych badań zaprezentowano w tabeli poniżej. Początkowo (P1) liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus wynosiła 1,2×108 jtk/g, a bakterii z rodzaju Bifidobacterium 5,6×108 jtk/g. W kolejnych etapach (P2, P3, P4) liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus była zbliżona do wartości wyjściowej. Wzrost zaobserwowano w ostatnim etapie (P5), w którym liczebność bakterii z rodzaju Lactobacillus wynosiła 8,6×108 jtk/g. Większym zmianom uległa liczba bakterii z rodzaju Bifidobacterium. Wzrost liczby bakterii tego rodzaju zaobserwowano w etapie (P2), symulującym warunki panujące w żołądku, gdzie ich liczba wynosiła 7,4×108 jtk/g. W kolejnym etapie, symulującym środowisko jelita cienkiego w obecności soku trzustkowo-jelitowego liczba Bifidobacterium uległa obniżeniu do wartości 1,2×108 jtk/g. W kolejnym punkcie pomiarowym (P4), liczba Bifidobacterium obniżyła się, a jej wartość była bliska liczebności wyjściowej i wynosiła 5,2×108 jtk/g. Po zakończeniu etapu symulującego pasaż przez jelito grube (P5) liczba Bifidobacterium znów wzrosła i wynosiła 8,1×108 jtk/g.
Na podstawie przeprowadzonego doświadczenia można wywnioskować, że sok Bobo-Frut, zastosowany jako atrakcyjne źródło błonnika zapewnił dobre warunki do wzrostu i namnażania zarówno dla bakterii z rodzaju Lactobacillus, jak i bakterii z rodzaju Bifidobacterium. Uzyskane po procesie trawienia in vitro liczebności badanych grup drobnoustrojów były wyższe od wartości początkowych. Fakt ten może być powiązany ze składem tej matrycy żywieniowej. W sokach owocowych znajduje się wiele substancji (błonnik, białka i polifenole) mających działanie ochronne w stosunku do drobnoustrojów. Ponadto soki warzywno-owocowe mają działanie buforujące, co zwiększa przeżywalność drobnoustrojów w czasie pasażu przez przewód pokarmowy.
Tabela 3. Kinetyka zmian liczby bakterii fermentacji mlekowej wchodzących w skład płynnego produktu probiotycznego w czasie pasaży żołądkowo-jelitowego w obecności soku Bobo Frut
| per 100 ml | per serving10 ml | % RWS* | ||
|---|---|---|---|---|
| energy | 82 kJ/19 kcal | 8 kJ/2 kcal | 0% | |
| fat | 0 g | 0 g | 0% | |
| including saturated fatty acids | 0 g | 0 g | 0% | |
| carbohydrates | 4,2 g | <0,5 g | 0% | |
| including sugars | <0,5 g | 0 g | 0% | |
| fiber | <0,5 g | 0 g | - | |
| protein | <0,5 g | 0 g | 0% | |
| salt | <0,01 g | 0 g | 0% |
W kolejnym etapie badań analizowano wpływ dodatku matrycy żywieniowej – kleiku ryżowego Bobo Vita na wzrost bakterii z rodzaju Lactobacillus i bakterii z rodzaju Bifidobacterium. Wyniki przeprowadzonych badań zaprezentowano w tabeli poniżej. Początkowo (P1), liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus wynosiła 3,3×108 jtk/g, a bakterii z rodzaju Bifidobacterium 6,6×108 jtk/g. W trakcie kolejnych etapów pasażu drobnoustrojów w warunkach symulujących przewód pokarmowy zaobserwowano podobną tendencję zmian liczby bakterii z rodzaju Lactobacillus oraz bakterii z rodzaju Bifidobacterium. W etapie symulującym warunki panujące w żołądku liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus uległa niewielkiemu obniżeniu w stosunku do wartości wyjściowej i wynosiła 2,7×108 jtk/g. Liczebność Bifidobacterium także uległa obniżeniu do wartości 5,1×108 jtk/g. W kolejnych etapach (P3 i P4), zarówno liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium obniżała się, odpowiednio do wartości 1,3×108 jtk/g (P3), 5,5×107 jtk/g (P4) i 1,7×108 jtk/g (P3), 5,2×107 jtk/g (P4). Wzrost liczby badanych drobnoustrojów zaobserwowano w ostatnim etapie prowadzonego eksperymentu (P5), w którym liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus wynosiła 5,8×108 jtk/g, a liczba bakterii z rodzaju Bifidobacterium 6,1×108 jtk/g.
Na podstawie przeprowadzonego doświadczenia można wywnioskować, że kleik ryżowy Bobo Vita nie zapewnił odpowiednio dobrych warunków dla wzrostu i namnażania bakterii z rodzaju Lactobacillus fermentacji mlekowej i bakterii z rodzaju Bifidobacterium. Uzyskane liczebności badanych grup drobnoustrojów były co prawda wyższe od wartości początkowych, ale i tak niższe w porównaniu do innych, badanych matryc żywieniowych. Jednak warto podkreślić funkcję ochronną ziaren skrobi, która może polegać na otaczaniu komórek bakterii, chroniąc je tym samym przed negatywnym wpływem środowiska.
Tabela 4. Kinetyka zmian liczby bakterii fermentacji mlekowej wchodzących w skład płynnego produktu probiotycznego w czasie pasażu żołądkowo-jelitowego w obecności kleiku ryżowego Bobo Vita
| w 100 ml | w porcji 10 ml | % RWS* | ||
|---|---|---|---|---|
| energia | 82 kJ/19 kcal | 8 kJ/2 kcal | 0% | |
| tłuszcz | 0 g | 0 g | 0% | |
| w tym kwasy tłuszczowe nasycone | 0 g | 0 g | 0% | |
| węglowodany | 4,2 g | <0,5 g | 0% | |
| w tym cukry | <0,5 g | 0 g | 0% | |
| błonnik | <0,5 g | 0 g | - | |
| białko | <0,5 g | 0 g | 0% | |
| sól | <0,01 g | 0 g | 0% |
Wnioski
Matryce żywnościowe pełnią funkcję ochronną, a także prebiotyczną dla bakterii o potencjale probiotycznym.
Spośród badanych matryc najlepsze warunki dla ochrony żywotności, wzrostu i rozmnażania bakterii wchodzących w skład produktów probiotycznych zapewniał preparat Nutramigen, co jest ściśle związane z jego bogatym składem.
Źródło: Badania nad oceną jakości i biofunkcjonalności produktów probiotycznych firmy Living Food Sp. z o.o.. Monografia Naukowa, 2019.
